9月21日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所金帆团队在Applied Microbiology and Biotechnology上在线发表题为“An adaptive tracking illumination system for optogenetic control of single bacterial cells” 的最新成果。

该研究开发了光遗传学领域自适应跟踪照明控制方法，通过高精度光投影结合高通量细菌跟踪算法和光遗传学，可以精确和持续地操纵运动和分裂的单细胞行为。

深圳先进院合成所助理研究员夏爱国、助理研究员张荣荣为文章的共同第一作者，金帆研究员为本文通讯作者，助理研究员杨帅为共同通讯作者。

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光遗传学是一种具有精确时空分辨率的快速、无创和细胞靶向操作的优秀工具，近年来受到研究人员的青睐。光遗传学操作的强大功能特别有利于在特定时间控制特定细胞类型。这能够帮助研究细胞内的某些生命进程或转化，尤其是在整个系统中有其他的生命进程或转化发生时。

光遗传学目前的应用主要是图案化或者区域化光刺激，或对秀丽线虫等个体较大的运动细胞提供持续光刺激，整体方法不适合亚微米级的细菌。在这篇文章中，作者介绍了一种在单细胞水平上精确操纵铜绿假单胞菌的基因表达和细菌行为的光遗传控制方法，自适应跟踪照明(adaptive tracking illumination, ATI)。作者通过高精度的自适应显微镜投影，结合高通量细菌跟踪算法和光遗传学，可以精确和持续地操纵运动和分裂的单细胞行为（图1）。

图1 ATI实现在单细胞水平的反馈光调控

该方法通过将空间光调制器的图案投影到高倍油镜的视场中，实现高精度的显微镜微投影。计算机再将获取到的显微镜明场图像经过实时地图像分割和细菌识别，获取细菌的实时轮廓及位置，通过反馈算法将细菌的轮廓投影到显微镜的视场中，实现对单细菌的精确光刺激。进一步结合实时的细菌追踪算法实现对目标细菌进行连续的光刺激，从而达到精确和持续地操纵运动和分裂的单细胞行为。

为了测试该方法潜在的应用，作者在细菌内应用了蓝光响应模块pDawn-Tn7，并在pDawn后表达绿色荧光蛋白sfGFP，从而使细菌内sfGFP荧光蛋白水平受到蓝光调控。上述基因改造的铜绿假单胞菌在流动池表面上正常运动，生长和分裂。可人为或者随机选定目标细菌，ATI将精确的持续为目标单细胞提供反馈式光遗传控制，而不影响其他的细菌。结果表明ATI在单细胞水平上很好地控制了细菌及其子代的绿色荧光蛋白sfGFP的表达（图2）。

图2 ATI精确调控单细胞内的基因表达

而后，研究人员进一步导入光遗传控制基因bphS调控环二聚鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的水平，在单细胞水平上中实现了对细菌内c-di-GMP的精确控制，从而操纵生物膜早期形成过程中细菌IV型菌毛(TFP)主导的蹭行运动和微菌落形成。此外，作者还利用ATI控制在生物被膜形成早期时细胞的空间组织（图3）。

图3 ATI控制生物被膜形成早期时的微菌落

在早期生物膜形成过程中，单细胞行为的研究是必不可少的。如何在单细胞的尺度上控制细菌的行为是研究人员一直探究的问题。自适应跟踪照明控制方法解决了由于细菌在表面运动和分裂等原因无法长时间连续对单个细菌进行光遗传控制的问题，将光遗传控制方法提升到单细胞的尺度上。结合显微镜拍摄图像的实时反馈，可实现个别细菌表型的特定光遗传学控制，拥有控制工程菌株生长运动的能力。

该工作获得国家重点研发计划项目，中科院仪器项目和国家自然科学基金青年基金等项目支持。