近年来随着生物技术的发展，肿瘤细胞疗法（利用人体免疫细胞治疗癌症等）展现出了令人瞩目的潜力，在实体瘤中的治疗效果尤为明显。

我们都知道，免疫系统是人体的守卫，保护人体免受病原体的侵袭，但免疫系统对于人体内的癌细胞却几乎不具有杀伤力。这是因为在肿瘤周围通常会形成一定的免疫豁免微环境，帮助肿瘤细胞逃过免疫系统追杀。然而，这独特的微环境也给细菌定殖提供了保障。基于此，肿瘤细菌疗法在近年来逐渐兴起。该治疗方法原理如下：利用细菌分泌特定的药物分子来打破肿瘤微环境，从而激活免疫系统杀死其周围的肿瘤细胞。

然而，如何精准地操控细菌在肿瘤周围释放药物分子是该疗法安全性所面临的主要挑战。

近日，来自加州理工学院Mikhail Shapiro课题组的研究人员开发了一种利用超声波遥控细菌分泌药物分子来治疗癌症的新技术，相关工作以“Ultrasound-controllable engineered bacteria for cancer immunotherapy”为题在Nature Communications上发表。

如何精准地操控细菌在肿瘤周围释放药物是肿瘤细菌疗法安全性的关键保障。

在此前的相关研究中，研究人员通常利用光诱导或化学诱导的方式对表达或释放过程进行调控。这两种方式在体外实验往往能够取得很好的效果，但却并不适用于人体。因为光信号几乎不能穿过人类表皮进入深层组织，而化学诱导所需的化学信号也很难实现在人体内的精准操控。

本文提出了一种新的基于超声波的精准操控技术，超声波（Focused Ultrasound, FUS）可以穿透人体表皮达到深层组织。基于此，研究人员设计构建了一种带有热响应元件的工程细菌（E. coli Nissle 1917），利用超声波精准定位有工程细菌定殖的肿瘤部位，通过超声波带来的能量热激活细菌进行药物释放，实现对癌细胞的精准杀伤。

►首先，研究人员在工程细菌中测试了热响应元件的性能。用于测试的基因线路如下图（Figure 1a）所示，为了方便表征，这里选用了绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因。研究人员设计构建了多个不同的热响应元件，并分别测试了它们在34°C到42°C间不同温度条件下对应报告基因表达量的变化情况，如Figure 1b所示。之后研究人员又测试了这几种元件在37°C（人体体温）以及42°C（超声波加热后的温度）这两个温度下报告基因的表达量。在这三种元件中，TcI42在这两种温度条件下的表达量差异最大，在37°C时报告基因几乎没有表达，而42°C时则有较高表达量。随后便在42°C条件下对TcI42进行进一步表征，其表达量与诱导时间的关系如Figure 1d所示。

Figure1 | 对E. coli Nissle 1917中温敏��录抑制剂的表征

随后，研究人员基于上述温控元件，构建了温控激活的工程细菌，并对其进行了优化。该菌株中的基因线路如图Figure 2a所示。研究人员希望利用该基因线路，在对病灶（菌株所在处）超声波热激活后，菌株能够持续表达目标分子从而抑制肿瘤生长。

其主要元件及作用原理如下：元件方面，GFP是绿色荧光蛋白，作为报告基因；tetR是四环素抗性基因，用于筛选；pR和pL是受到TcI42调控的启动子；Bxb1是一种丝氨酸整合酶，可以对特定的序列位点进行切割和连接，通过序列设计可以实现特定位点转向的功能。在37°C环境下，pR和pL被抑制，整个基因线路处于抑制状态；当利用超声波热激活后，环境温度升高至42°C，此时pR和pL被激活，Bxb1大量表达，将前面的P7启动子转向，进而激活GFP的表达。为了进一步减少37°C下的泄露率，研究人员对线路进行了进一步优化，引入了两个新变量：复制原点（low copy和medium copy）以及温控终止子，并据此设计了四种新的表达线路（Figure 2e），并测试了它们在37°C和42°C环境下的表达情况（Figure 2f）。

Figure2 | 温控表达元件的构建与优化

基于上述结果，研究人员进一步构建了能够释放免疫激活分子（αCTLA-4或PD-L1 nanobodies，用于激活免疫系统治疗癌症）的工程细菌。菌株基因线路设计如Figure 3a所示：该线路与Figure 2a中所示线路大体一致，不同之处在于新的线路中加入了Figure 2e中的温控终止子以及在GFP报告基因上游加入了表达治疗分子的基因。之后，研究人员测试了该元件在热激活一小时后的24小时内，基因线路处于激活状态的细菌的比例（Figure 3b）。从中可以看出，在37°C热激活下，几乎没有处于激活状态的细菌；而42°C和43°C热激活一小时，在24小时后还有大约20-30%的细菌处于激活状态。研究人员随后利用western blot技术测试了该菌株在不同温度下αCTLA-4 nanobodies（治疗分子）表达量（Figure 3c），从中我们可以看出，在37°C时几乎没有表达，42°C时表达量适中，43°时表达量较大。

Figure3 | 温控菌株释放治疗性分子

最后，研究人员在小鼠体内测试了该工程细菌的治疗效果。实验器具如Figure 4a所示：左侧是一个受到电脑控制的超声波信号发生器，其正对右侧小鼠的肿瘤病灶；小鼠的身上分别连接有测试其体温以及肿瘤部位温度的传感器。实验的具体流程如Figure 4b所示：在第0天对小鼠的右胁腹处皮下注射A20肿瘤细胞；在第七天，当肿瘤体积达到100 mm3时通过尾静脉注射工程细菌；在第九天，对肿瘤部位进行超声波热激活；随后测量肿瘤大小直到其超过1000 mm3。

Figure 4c中展示了不同实验组和对照组中，肿瘤体积的变化情况，可以看出，在第13天时，带有治疗分子的实验组（PD-L1 mAB + CTKA-4 mAB）将肿瘤体积维持在很低的水平（几乎与注射细菌之前相同），而对照组如Wildtype EcN, FUS以及未经激活的Therapeutic EcN，肿瘤体积大幅增长。超声激活的效果十分显著，有超声激活的实验组（+FUS）相较于阴性对照（-FUS），激活细菌的比例大幅提高（Figure 3d）。最后，研究人员还对分布在不同器官的细胞激活情况进行了统计，其中肿瘤部位（被超声热激活的部位）的激活比例在20 %以上，而肝脏及脾脏中则仅有不到5 %的细菌被激活。

Figure4 | 利用超声波激活的细菌免疫疗法抑制肿瘤增殖

总的来说，该研究开发了一种可以通过超声波遥控，对肿瘤部位实现精准杀伤的细菌免疫疗法。通过构建温敏表达元件，实现了使用超声波热激活操控工程细菌释放治疗性药物，进而定向杀伤癌细胞，从而抑制肿瘤增殖。该项研究对为细菌免疫疗法提供了新的思路，尤其适用于一些临床上容易识别但难以通过手术切除部位的原发性肿瘤（如颈部，卵巢，胰腺或脑部）。

除了应用于肿瘤治疗，本研究的超声波介导思路还可用于操控肠道微生物等场景，具有重要的指导意义。

参考文献：

1.Abedi MH, Yao MS, Mittelstein DR, et al.Ultrasound-controllable engineered bacteria for cancer immunotherapy. NatCommun. 2022;13(1):1585. Published 2022 Mar 24. doi:10.1038/s41467-022-29065-2

2.Abedi MH, Lee J, Piraner DI, Shapiro MG.Thermal Control of Engineered T-cells. ACS Synth Biol.2020;9(8):1941-1950. doi:10.1021/acssynbio.0c00238

通讯作者简介

Mikhail G. Shapiro, 加州理工学院化学工程教授

课题组研究方向包括生物声学（Bioacoustics，利用超声波成像或控制细胞功能，本文即在此列），生物磁学（Biomagnetism，磁共振成像以及磁驱动的新分子和机制），生物物理（Biophysics，利用超声波和其他形式的能量进行神经调节的生物物理学）以及生物化学（Biochemistry，在空间和时间上，从分子层面对神经线路进行精确调控）。近年来在Nature，Nature Nanotechnology，Nature Method，Nature Communications等知名期刊上发表多篇重要工作。

课题组主页：https://shapirolab.caltech.edu/ 

专家点评 

该研究聚焦在肿瘤细菌疗法，提出了使用聚焦超声作为“启动开关”控制基因工程细菌表达免疫药物治疗肿瘤的新思路。该研究的创新思路是通过构建温度敏感基因元件，利用超声波的热效应激活温度敏感基因元件，实现了工程细菌的基因表达操控。值得一提的是，由于超声波具有良好的组织穿透性和在体可聚焦性，可实现远端定点控制活体肿瘤内细菌的免疫药物的表达，拓展了基因表达调控新模式，该工作成功将合成生物学与超声医学进行交叉结合，为活体水平基因表达控制以及肿瘤细菌治疗研究提供了新的解决方案。

#感谢严飞老师的点评与指导

严飞，中国科学院深圳先进技术研究院研究员，博士生导师，国家重点研发计划首席科学家。2007年毕业于四川大学生物治疗国家重点实验室，2008-2009年在清华大学从事博士后研究。2010年加入中国科学院深圳先进技术研究院，历任助理研究员、副研究员和研究员；兼任中国超声医学工程学会超声分子影像专业青年委员会副主任委员，中国超声医学工程学会超声治疗及生物效应专委会常务委员，中国生物医药技术协会纳米生物技术分会委员；主持国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省自然科学基金、深圳市基础研究计划等项目10项，参与多项国家973计划、国家自然科学基金重点基金项目的研究；在Nature Communications,Advanced Functional Materials, Advanced Science, Biomaterials, Radiology等国际学术期刊上发表论文80余篇，申请发明专利10余项，转让4项，参与编写专著3部。

联系方式：0755-86570346联系邮箱：fei.yan@siat.ac.cn

个人网站：http://people.ucas.edu.cn/~FeiYAN  

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撰文 | 寻东民

校对 | 陈茜

编辑 | 李佩芸