唯一不变的就是变化本身，对细胞而言亦是如此。一个受精卵发育为一个复杂个体，正常体细胞变成肿瘤细胞，细胞作为生命的基本单位，其状态的动态变化既是健康发育的基础也是疾病产生的原因。从光学显微镜对细胞形态变化的观察，到绿色荧光蛋白对细胞基因、表达定位等变化的追踪，再到分子记录器在基因组中稳定写入曾经发生的分子事件，以及单细胞转录组测序的发展允许了细胞全转录组的变化拟时序推测，每一次细胞动态变化记录的技术变革都极大的推动了细胞生物学的发展。同时，应当认识到，既有的方法要么受限于对细胞形态或者少数几个基因的动态表征，要么依赖于拟时序分析中多种在实际细胞体系中可能无法满足的假设，我们目前还不能直接地测量细胞全转录组状态变化。

8月17日，中国科学院深圳先进技术研究院与瑞士洛桑联邦理工学院Bart Deplancke课题组、苏黎世联邦理工学院Julia Vorholt课题组的合作成果以article长文的形式在Nature上发表。题目为《Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells》。

深圳先进院合成生物学研究所陈万泽研究员（原瑞士洛桑联邦理工学院博士后）、Orane Guillaume-Gentil、Bart Deplancke和Julia Vorholt为共同第一作者。

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这项研究开发了活细胞转录组测序技术（Live-seq），首次实现了让单细胞进行转录组测序后依然能够保持细胞存活。该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态和其后续表型的唯一解决方案。

基因表达程序的变化是细胞对外源和内源刺激反应的重要表现。对单个细胞的连续观测一直是细胞对刺激反应、变化的重要研究手段，活细胞成像应该是最早的方法。随着显微成像技术的发展和荧光标记手段的进步，显微成像已经可以实现从从体外细胞培养到体内环境下实现对基因表达的动态观测。基因编辑技术的发展促进了分子记录器的出现。通过细胞原生的或者人工合成的基因线路，对刺激的感应并将信息写入基因组，实现对历史分子事件的记录。这些技术的发展和应用，促进了细胞生物学的研究，如活细胞成像已经成为了现代细胞生物学实验室的常用的一种手段；分子记录器虽然出现不久，但是它在体内多场景的适用性和稳定性上有很大的潜力。但是，它们在记录基因表达上有一个共同的限制：在一个细胞中只能同时记录一个或几个基因的表达。

另一方面，自2009年汤富酬首创了单细胞mRNA测序以来，我们不再只依靠少数几个基因的表达来了解细胞类型，而可以用整个转录组的状态来更加系统全面的定义细胞类型和状态。单细胞转录组变革了我们对细胞状态异质性的解析能力，推动了发育生物学、肿瘤细胞学、免疫学和干细胞生物学等各个领域的发展。然而，我们只能测量细胞的静态状态，无法像前述的活细胞成像那样连续观测细胞的动态或者检查细胞��续的表型。为了克服这个限制，多种基于计算或者标记的方法被开发出来，这些方法基于一个共同的假设：群体的静态分布可以模拟个体的动态运动。通过不同的数学模型和/或对新旧RNA的标记等手段，把转录组相似的细胞连接起来产生一条轨迹来代表一个细胞的变化路径。这些方法提供了大量有意义的生物学认知，但是同时值得注意的是，由于这些方面的前提假设在复杂细胞系统不一定能被满足，其提供的变化路径应该被解读为一种统计学上的预期，而非细胞真正变化的轨迹。而这些限制的根本原因是单细胞测序时裂解杀死了细胞，因而无法连续测量。

针对这个挑战，陈万泽研究员和合作者此次开发了活细胞转录组测序Live-seq，在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能。其核心是对部分细胞质进行微创地提取，并对及其微量的细胞质RNA进行扩增。具体地，该方法整合改造了多种跨学科技术（如图一）：1）具备纳米级移动分辨率和皮牛顿力学灵敏度的原子力显微镜，实现超精密显微操作；2）亚皮升级别的微/纳流控通道和液压调节系统，实现微量（约1皮升）样品提取和转移；3）纳米级的、中空可定量的、可和细胞膜无缝密封的特殊探针，可以实现微创的细胞质提取；4）相偶联的实时跟踪成像和细胞培养系统，可以长时间锁定同一个细胞；5）高灵敏度的RNA扩增测序；6）对前述步骤的无缝整合。

图一 Live-seq的基本原理

Live-seq只是对少量的细胞质进行测序，其结果是否能代表细胞的状态？为了回答这个问题，作者对多种类型和状态的细胞进行活细胞测序，并平行地和单细胞测序结果进行比较。结果显示活细胞测序结果和单细胞测序结果高度吻合，证明了Live-seq能够很好的体现细胞的全转录组状态。另一个疑问就是这个过程是否会改变细胞状态甚至杀死细胞。首先，作者对包括干细胞在内的多种细胞类型进行评估，发现绝大部分细胞在Live-seq后仍然存活。同时，细胞分裂依然能够正常进行（图二）。然后，通过对巨噬细胞对细菌脂多糖LPS刺激的反应和脂肪干细胞分化过程的观测，发现细胞的反应没有因Live-seq有明显变化。最后，对接受和未接受细胞质提取的细胞全转录组进行比较，也未发现大量的基因表达变化。这些结果显示，Live-seq没有对细胞的活性和功能产生较大影响。

图二 Live-seq对细胞的影响。黄色的细胞被提取了细胞质，蓝色和紫色的细胞没有被处理

由于细胞测试后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。作为概念验证，Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞和脂肪干细胞在刺激前后的变化路径（如图三显示）。Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在。即使是单克隆来源的巨噬细胞对细菌脂多糖的反应依旧有很大的异质性。利用这个模型，作者展示起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia, Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因，同时处于细S期的细胞对刺激反应也更弱。对应的，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。

图三 活细胞测序的新可能：（左图）对同一个细胞转录组的连续分析；（右图）偶联细胞起始的转录组状态（因）和后续细胞对刺激的反应（果）

Live-seq仍然有多个缺点。比起高通量的单细胞转录组，Live-seq还是一个低通量的手段；Live-seq目前还不能在体内应用；在高度极化而mRNA分布不均的细胞（如神经细胞）中，Live-seq可能无法体现全细胞转录组；更加多次的采样对细胞的干扰还需要更多的研究。通过未来持续的发展，如自动化提高通量、通过和双光子显微镜联用运用于体内样品等，这些缺点有望得到改善和克服。尽管仍然有很多不足，Live-seq第一次使得对活细胞的连续观测成为可能，希望这个可能可以催生更多新的可能。

该研究得到了国家重点研发计划及深圳合成生物创新研究院的支持。